第二代试管婴儿技术是卵胞浆内单精子注射技术，是指在显微镜下，人为挑选出活力好、形态正常的单个精子，通过显微操作技术将其直接注射到卵子细胞浆内，帮助完成受精过程。在进行完详细的试管婴儿术前检查后，确定患者符合试管婴儿指征，则开始进入试管婴儿周期。
具体的六大步骤如下：
一、促排卵
为打破女性受自然周期的限制，需要采用控制性超排卵来增强与改善卵巢功能，从而获得多枚健康卵子，提供多个胚胎移植，并尽可能使黄体发育与子宫内膜功能同步。先用GnRHa降调，再采用排卵药物，刺激卵巢中的卵泡成长，依据患者对药物的反应性调整药物使用剂量，不同年龄的患者药物的使用剂量也不同。
二、注射HCG
为评估卵巢刺激效果并决定取卵时间，须利用阴道B超来监测卵泡大小，当二至三个以上的卵泡直径大于1.8cm，且1.4cm 以上的卵泡数与E2值相当，便可注射人绒毛促性腺激素(hCG)，促使卵泡成熟。
三、取卵，取精
在注射hCG后34~36小时取卵。最常用的取卵方式是在的局部麻醉下，经阴道B超引导，将取卵针穿过阴道穹窿，直达卵巢吸取卵子，并立即在显微镜下将卵子移到含胚胎培养液的培养皿中，置37°C的培养箱中培养。
对于部分无精症的患者，睾丸内可能有精子生成，或者排精障碍、输出管道的堵塞或其他原因导致的精子排出困难，精液标本中没有精子。这些患者行经皮附睾穿刺(PESA)或经皮睾丸穿刺(TESA)，可以获得少量精子。
四、受精
取卵后4~5小时，将处理后的精子，人为选择活力好、形态正常的单个精子，将其直接注射到卵子细胞浆内，帮助完成受精过程。
五、胚胎培养
受精卵在体外培养48~72小时可发育到8~16细胞期胚胎。此时依据患者的年龄、曾经怀孕与否及胚胎的质量，决定移植胚胎的数目，多余的胚胎可冷冻保存。同时也可通过推迟移植时间，自然筛选淘汰劣质胚胎，可提高妊娠率，降低多胎率。
六、黄体支持，14天后验孕
移植后继续黄体酮支持黄体。如果确定妊娠，则改用hCG继续补充到怀孕10周。胚胎移植后14天，可由验尿或抽血确定是否妊娠。
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